Biotecnologia

Numa manhã de 2021, uma enfermeira gira um cotonete no fundo do nariz de um paciente. Horas depois, uma máquina informa que havia ali RNA do SARS-CoV-2, embora a amostra tivesse tão pouco material que nenhum microscópio o encontraria. No mesmo hospital, uma pessoa com diabetes aplica insulina humana, idêntica à que o pâncreas dela não produz, fabricada por bactérias num tanque. No laboratório ao lado, um gel com algumas listras escuras decide uma ação de paternidade. E em 1996, numa fazenda da Escócia, nasceu uma ovelha que não tinha pai, porque o núcleo de uma célula da glândula mamária de outra ovelha foi colocado num óvulo esvaziado.

As quatro cenas parecem assuntos diferentes, e no PAS 3 elas aparecem em blocos diferentes: a soja transgênica num ano, as ossadas de desaparecidos políticos em outro, a terapia gênica num terceiro. Mas todas usam a mesma meia dúzia de ferramentas: enzimas que cortam o DNA em pontos conhecidos, uma enzima que o emenda, moléculas que o copiam, um campo elétrico que separa os pedaços pelo tamanho e vetores que o carregam para dentro de uma célula. Esta página apresenta essas ferramentas uma a uma e, depois, as aplicações que a prova e o noticiário cobram: transgênicos e quem os autoriza no Brasil, testes de DNA, PCR, sequenciamento, clonagem, células-tronco, terapia gênica, CRISPR e as vacinas que são, elas mesmas, produtos de engenharia genética. O que vem antes fica em páginas próprias: a estrutura do DNA e a síntese de proteínas em DNA, RNA e síntese proteica, as bactérias e seus plasmídeos em bactérias, as alterações do DNA em mutações, a herança dos alelos em leis de Mendel, a fermentação como metabolismo em fermentação, a imunologia das vacinas em vacinas e soros e os vírus usados como vetores em vírus.

Biotecnologia é mais antiga que o laboratório

Biotecnologia é qualquer uso de organismos vivos, de células ou de moléculas extraídas deles para produzir um bem ou realizar um processo. A definição é ampla de propósito, e a prova usa a amplitude dela como armadilha: quem pensa que biotecnologia é sinônimo de transgênico erra duas vezes, porque deixa de fora milênios de técnica e porque promove a inserção de genes a condição necessária de algo que ela não é.

Dentro dessa definição cabem três famílias de técnica, de idades muito diferentes, e saber em qual delas um caso se encaixa é o que a maioria dos itens pede.

Pôr um microrganismo para trabalhar. Fermentar uva, cevada, leite ou massa de trigo é usar leveduras e bactérias lácticas para transformar açúcar em etanol, gás carbônico ou ácido láctico. O pão, a cerveja, o vinho, o queijo e o iogurte existem há milhares de anos; a penicilina, extraída do fungo Penicillium a partir das observações de Fleming em 1928 e produzida em escala industrial nos anos 1940, pertence à mesma família; o etanol combustível brasileiro, fermentado da cana desde o Proálcool de 1975, também. Nenhum desses processos mexe no DNA de ninguém. A bioquímica da fermentação está em fermentação; aqui ela interessa como a biotecnologia mais antiga que existe.

Escolher quem se reproduz. O milho atual descende de uma gramínea mexicana de espigas minúsculas, o teosinto; o cão descende do lobo; toda raça de gado, toda variedade de arroz e toda fruta de supermercado foram produzidas por seleção artificial: a cada geração, só os indivíduos com a característica desejada deixam descendentes. Esse é o melhoramento genético, ou domesticação quando se fala de uma espécie selvagem transformada ao longo de séculos. A técnica muda a frequência dos alelos que a espécie já tinha, e pode mudar tanto que a planta domesticada ganha outro nome de espécie. Mas não acrescenta nenhuma letra de DNA de fora. Por isso um organismo domesticado, por mais diferente que seja do ancestral, não é um organismo geneticamente modificado no sentido legal, e a prova de 2025 cobrou exatamente isso a partir de uma reportagem sobre um fruto amazônico domesticado por povos indígenas (item 68, errado ao chamá-lo de OGM). O mecanismo da seleção artificial, comparado ao da seleção natural, está em seleção natural.

Inserir DNA de fora. Em 1973, Stanley Cohen e Herbert Boyer cortaram um gene de um organismo, colaram-no num plasmídeo e puseram o plasmídeo dentro de uma bactéria, que passou a copiá-lo e a expressá-lo. Nasceu a tecnologia do DNA recombinante, e com ela a engenharia genética: a modificação direta do genoma em laboratório. Um organismo que recebeu um gene de outra espécie é transgênico; o termo organismo geneticamente modificado (OGM) é o nome da legislação brasileira para qualquer organismo cujo material genético foi alterado por técnica de engenharia genética, o que inclui os transgênicos e também organismos que receberam genes da própria espécie ou tiveram genes desligados.

Por que um gene humano funciona dentro de uma bactéria

A engenharia genética só é possível porque o DNA é a mesma molécula em todos os seres vivos e porque o código genético é quase universal: o códon GAA significa ácido glutâmico tanto no ribossomo de uma bactéria quanto no de uma pessoa. Uma bactéria que recebe o gene da insulina humana transcreve e traduz esse gene com a própria RNA-polimerase e os próprios ribossomos, e o resultado é uma cadeia de aminoácidos com a sequência humana. É a consequência prática do que a página de DNA, RNA e síntese proteica explica: a informação está na ordem das bases, e a maquinaria que a lê é compartilhada.

Há dois limites, e os dois aparecem em questões. O primeiro é o splicing: genes humanos têm íntrons, e bactérias não os removem. Por isso o gene inserido numa bactéria costuma ser um DNA complementar (cDNA), copiado a partir do RNA mensageiro maduro, já sem íntrons, usando a transcriptase reversa, a enzima que os retrovírus usam para copiar RNA em DNA. O segundo limite são as modificações pós-traducionais: muitas proteínas humanas precisam receber açúcares (glicosilação), ser dobradas com ajuda de chaperonas ou cortadas em pontos precisos depois da tradução, e bactérias não fazem isso do jeito humano. Quando a proteína exige esses acabamentos, o produtor escolhido é uma levedura ou uma célula de mamífero em cultura. A regra de bolso: proteína simples, bactéria; proteína com açúcares ou dobramento complexo, levedura ou célula animal.

O veículo mais usado para levar um gene a uma bactéria é algo que as bactérias já têm. Além do cromossomo, muitas carregam plasmídeos: moléculas pequenas de DNA circular, de poucos milhares de pares de bases, com poucos genes, que se replicam por conta própria e podem passar de uma célula a outra por conjugação. Na natureza, plasmídeos espalham genes de resistência a antibióticos; no laboratório, viram o vetor padrão porque são pequenos, fáceis de isolar, entram em bactérias e são copiados por elas. O PAS 3 de 2024 (item 48, tipo C) pediu o nome das “moléculas adicionais de DNA circular” das bactérias: plasmídeo. A biologia dos plasmídeos e da conjugação está em bactérias.

A caixa de ferramentas: enzimas de restrição, ligase e vetores

As enzimas de restrição (endonucleases de restrição) são proteínas bacterianas que cortam o DNA de fita dupla em sequências específicas. Na bactéria, elas são defesa: destroem o DNA de vírus bacteriófagos, enquanto o DNA da própria célula fica protegido porque tem grupos metila nos mesmos sítios. Cada enzima reconhece uma sequência curta, em geral de quatro a oito pares de bases, e a sequência costuma ser palindrômica: lida de 5’ para 3’, é igual nas duas fitas. A EcoRI, da bactéria Escherichia coli, reconhece GAATTC; a fita complementar, lida no mesmo sentido, também é GAATTC. O nome diz a origem: gênero (E), espécie (co), linhagem ® e ordem de descoberta (I).

O modo de cortar importa. Algumas enzimas cortam as duas fitas no mesmo ponto e deixam extremidades cegas (SmaI corta CCC|GGG). Outras cortam deslocado e deixam extremidades coesivas, fitas simples curtas que sobram em cada ponta: a EcoRI corta G|AATTC, e cada fragmento termina com um AATT de fita simples. Dois fragmentos cortados pela mesma enzima têm extremidades complementares e se encaixam por pareamento de bases, venha o DNA de uma bactéria, de uma planta ou de uma pessoa. É por isso que um gene humano e um plasmídeo bacteriano, cortados pela mesma enzima, se juntam.

Encaixar não é unir. O pareamento das extremidades coesivas é temporário; quem forma a ligação covalente entre o açúcar de um nucleotídeo e o fosfato do vizinho, soldando o corrimão da fita, é a DNA ligase, a mesma enzima que une os fragmentos de Okazaki na replicação. O produto, um DNA com trechos de duas origens, é o DNA recombinante.

Exemplo resolvido: contar fragmentos. Uma molécula de DNA linear de 5 000 pares de bases tem dois sítios de EcoRI, nas posições 1 200 e 3 500 contadas de uma das pontas. Quantos fragmentos a digestão completa produz, e de que tamanhos? E se a molécula fosse circular?

Numa molécula linear, cada corte aumenta em um o número de pedaços: dois cortes, três fragmentos. Os tamanhos saem por subtração: do início até 1 200, um fragmento de 1 200 pb; de 1 200 a 3 500, um de 2 300 pb; de 3 500 ao fim, um de 1 500 pb. Conferência: 1 200 + 2 300 + 1 500 = 5 000. Numa molécula circular não há pontas, e o primeiro corte apenas a abre: dois cortes dão dois fragmentos, de 2 300 pb (entre os sítios) e de 2 700 pb (o resto do círculo, 1 200 + 1 500). A regra: linear, fragmentos = cortes + 1; circular, fragmentos = cortes. Essa conta é o que permite ler um gel de restrição, assunto de uma seção adiante.

Cortar e colar o gene não basta: ele precisa entrar numa célula e ser copiado por ela. Quem o leva é o vetor. Para bactérias, o vetor é o plasmídeo. Para células animais, costumam ser vírus modificados, que perderam os genes de replicação e ganharam o gene de interesse, como os adenovírus e os vírus adenoassociados (AAV) usados em terapia gênica e em vacinas. Para plantas, o vetor natural é a bactéria Agrobacterium tumefaciens, que na natureza injeta um pedaço de seu plasmídeo Ti no genoma da planta para fazê-la produzir um tumor; a engenharia genética retirou os genes do tumor desse plasmídeo e os substituiu pelo gene desejado, e a bactéria faz o resto. A alternativa, quando a Agrobacterium não infecta a planta, é a biobalística: micropartículas de ouro ou tungstênio revestidas de DNA são disparadas contra as células.

Pôr um plasmídeo dentro de uma bactéria chama-se transformação. No laboratório, as bactérias são tratadas com cloreto de cálcio e submetidas a um choque térmico, ou recebem um pulso elétrico (eletroporação), que abre poros temporários na membrana. Só uma pequena fração das células recebe o plasmídeo, e por isso o vetor carrega o gene marcador: as bactérias são espalhadas num meio com antibiótico, e só crescem as que receberam o plasmídeo com o gene de resistência. Cada colônia na placa descende de uma única bactéria transformada e carrega milhões de cópias idênticas do gene inserido. Esse é o sentido original da palavra clonagem: clonar um gene é obter muitas cópias idênticas dele.

Clonagem molecular: o roteiro completo e a insulina

Junte as peças e o roteiro de uma clonagem molecular fica assim: (1) obter o gene, por corte com enzima de restrição a partir do genoma ou, mais comum, como cDNA copiado do RNA mensageiro; (2) cortar o plasmídeo com a mesma enzima; (3) misturar os dois e adicionar DNA ligase, formando o DNA recombinante; (4) transformar bactérias; (5) selecionar no antibiótico as que receberam o plasmídeo; (6) confirmar, por PCR ou sequenciamento, quais colônias receberam o plasmídeo com o gene e não o plasmídeo que se fechou vazio; (7) cultivar as bactérias certas em grande volume e purificar a proteína ou o DNA.

Insulina: o primeiro remédio feito por bactéria. Até o início dos anos 1980, a insulina usada por pessoas com diabetes era extraída de pâncreas de bois e porcos, moídos aos milhares em frigoríficos; as moléculas animais diferem da humana em um ou poucos aminoácidos, e uma parte dos pacientes desenvolvia reações. Em 1978, a empresa Genentech inseriu em E. coli os genes sintéticos das duas cadeias da insulina humana, a A e a B, produziu cada uma separadamente e as uniu quimicamente; em 1982, a insulina humana recombinante foi aprovada para uso, o primeiro medicamento de engenharia genética a chegar ao paciente. Hoje a insulina e seus análogos de ação rápida ou prolongada também são produzidos em leveduras, que secretam a proteína para o meio de cultura.

O mesmo roteiro fabrica o hormônio do crescimento humano (antes extraído de hipófises de cadáveres, com risco de transmitir a doença de Creutzfeldt-Jakob), a eritropoetina que estimula a produção de hemácias, o fator VIII da coagulação para hemofílicos (antes obtido de sangue doado, com o risco de transmissão de HIV e hepatites dos anos 1980), os anticorpos monoclonais usados contra cânceres e doenças autoimunes, a quimosina que coalha o leite na fabricação de queijo (a primeira enzima recombinante aprovada para alimentos, em 1990) e a proteína de superfície do vírus da hepatite B que é a vacina contra essa doença.

PCR: fotocopiar um trecho de DNA um bilhão de vezes

A reação em cadeia da polimerase (PCR) copia um trecho escolhido de DNA milhões ou bilhões de vezes num tubo, em poucas horas, sem célula nenhuma. Foi concebida por Kary Mullis em 1983 (Nobel de Química de 1993) e é hoje a técnica mais usada da biologia molecular: está por trás do teste de covid, do teste de paternidade, do diagnóstico de HIV e de tuberculose, da identificação de espécies em alimentos e da maior parte do que se faz num laboratório de genética.

O tubo contém seis coisas: o DNA molde, com o trecho a copiar; dois iniciadores (primers), fitas curtas de DNA sintético, de cerca de 20 nucleotídeos, complementares às duas pontas do trecho, uma em cada fita; os quatro nucleotídeos livres (dNTPs); uma DNA-polimerase; íons magnésio, de que a enzima precisa; e um tampão. Depois, o tubo vai para um termociclador, que repete um ciclo de três temperaturas.

1. Desnaturação, cerca de 95 °C. O calor rompe as ligações de hidrogênio entre as bases e separa as duas fitas. Não há helicase: a separação é só térmica.
2. Anelamento, entre cerca de 50 e 65 °C. Com a temperatura mais baixa, os iniciadores pareiam com as sequências complementares nas fitas do molde. Como estão em enorme excesso, eles chegam antes que as fitas longas voltem a se juntar.
3. Extensão, 72 °C. A polimerase parte da ponta 3’ de cada iniciador e sintetiza a fita complementar, nucleotídeo a nucleotídeo, no sentido 5’→3’.

Ao fim de um ciclo, cada molécula de molde virou duas. No ciclo seguinte, as duas viram quatro; depois oito, dezesseis. Como os iniciadores delimitam o trecho, a partir do terceiro ciclo a maioria das cópias tem exatamente o tamanho entre eles. Depois de $n$ ciclos, uma molécula inicial gera, no máximo, $2^{n}$ cópias; com 30 ciclos, $2^{30} \approx 1{,}07 \times 10^{9}$, um bilhão de cópias a partir de uma, em cerca de duas horas.

O detalhe que tornou a técnica prática é a enzima. Uma DNA-polimerase humana ou de E. coli se desnatura a 95 °C, e seria preciso acrescentar enzima nova a cada ciclo. A solução veio de uma fonte termal do Parque de Yellowstone: a bactéria Thermus aquaticus, descrita por Thomas Brock em 1969, vive a 70 °C, e sua polimerase, a Taq, resiste à desnaturação. Com a Taq, o tubo é fechado uma vez e a máquina faz o resto.

Exemplo resolvido: quantos ciclos. Uma amostra forense contém cerca de 10 moléculas de DNA com o trecho de interesse. Quantos ciclos de PCR, no mínimo, são necessários para passar de 10 milhões de cópias, supondo eficiência máxima?

Com eficiência máxima, cada ciclo dobra o número: depois de $n$ ciclos há $10 \times 2^{n}$ cópias. Queremos $10 \times 2^{n} \gt 10^{7}$, ou $2^{n} \gt 10^{6}$. Como $2^{10} = 1\,024 \approx 10^{3}$, $2^{20} = 1\,048\,576 \approx 10^{6}$: com 20 ciclos, $10 \times 2^{20} \approx 1{,}05 \times 10^{7}$, pouco acima de 10 milhões; com 19, $10 \times 524\,288 \approx 5{,}2 \times 10^{6}$, abaixo. Resposta: 20 ciclos. Conferência pelo expoente: $2^{20} = (2^{10})^{2} = 1\,024^{2}$, que é um pouco mais de um milhão. Na prática, a eficiência cai nos últimos ciclos, e por isso os protocolos usam de 30 a 40.

O teste de covid e a carga viral. O SARS-CoV-2 tem genoma de RNA, e a PCR copia DNA. O teste do cotonete é um RT-PCR: primeiro a transcriptase reversa (RT) copia o RNA viral em cDNA; depois a PCR amplifica trechos escolhidos do cDNA. Na versão em tempo real (qPCR), uma sonda fluorescente se acende a cada cópia feita, e a máquina acompanha a fluorescência ciclo a ciclo: quanto mais RNA viral havia na amostra, menos ciclos são necessários para a fluorescência passar de um limiar. Esse número de ciclos, o Ct, é a medida indireta da quantidade de vírus. O mesmo princípio dá a carga viral do HIV, em cópias de RNA por mililitro de sangue, usada para acompanhar o tratamento: carga “indetectável” significa abaixo do limite do aparelho, não ausência do vírus. Duas consequências que itens exploram: um RT-PCR positivo detecta RNA do vírus, e não prova que havia partículas viáveis; e o teste de PCR não lê o genoma do paciente nem o altera, ele só copia um trecho do material genético que estava na amostra.

Eletroforese e o teste de DNA: o gel conta pelo tamanho

Toda técnica desta página produz fragmentos de DNA, e a maneira de vê-los é a eletroforese em gel. O gel é uma placa de agarose (ou poliacrilamida, para fragmentos pequenos) mergulhada numa solução condutora, com poços numa das pontas. As amostras entram nos poços, liga-se uma corrente, e o DNA migra para o polo positivo, porque cada nucleotídeo tem um grupo fosfato com carga negativa. O gel é uma malha: fragmentos pequenos passam fácil e vão longe, fragmentos grandes ficam presos e andam pouco. Ao fim, cada tamanho forma uma banda, e um corante que se liga ao DNA as torna visíveis sob luz ultravioleta ou azul. Num dos poços corre um marcador de peso molecular, mistura de fragmentos de tamanhos conhecidos, que serve de régua.

Ler um gel é, portanto, ordenar por tamanho: perto do poço, as moléculas grandes; longe dele, as pequenas. No exemplo da digestão com EcoRI, os três fragmentos de 2 300, 1 500 e 1 200 pb formariam três bandas, a de 2 300 mais perto do poço e a de 1 200 mais longe. Proteínas também podem ser separadas por eletroforese, e é assim que um hemocentro distingue a hemoglobina A da hemoglobina S, com uma carga diferente por causa de um aminoácido trocado; esse exame está em mutações.

Marcadores genéticos e o perfil de DNA. Duas pessoas quaisquer têm genomas 99,9 % iguais; o teste de DNA olha só para os 0,1 % que variam. As regiões mais usadas são as repetições curtas em tandem (STR): trechos de DNA não codificador em que uma unidade de duas a seis bases se repete em fila, e o número de repetições varia de pessoa para pessoa. Num certo locus, uma pessoa pode ter 7 repetições num cromossomo e 11 no homólogo; outra, 9 e 9. Cada pessoa tem dois alelos por locus, um herdado da mãe e um do pai. Para montar o perfil, amplifica-se por PCR cada locus e se mede, por eletroforese, o tamanho dos fragmentos: mais repetições, fragmento maior, banda mais perto do poço. O sistema CODIS, usado nos bancos de perfis forenses, combina 20 loci; com tantos loci independentes, a chance de duas pessoas não aparentadas terem o mesmo perfil é da ordem de uma em muitos bilhões.

Paternidade. A regra é uma só: em cada locus, a criança tem um alelo da mãe e um do pai. Risque, no perfil da criança, o alelo que veio da mãe; o que sobra tem de estar no pai verdadeiro, em todos os loci. Um suposto pai que não tenha o alelo esperado em dois ou mais loci está excluído. Um que tenha todos os alelos esperados é compatível, e os laboratórios calculam a probabilidade de paternidade, em geral acima de 99,99 %. O resultado do teste é uma exclusão certa ou uma inclusão probabilística, nunca uma “prova de 100 %”.

Exemplo resolvido: ler um gel de paternidade. Em três loci STR, os perfis (número de repetições em cada alelo) são: mãe 8/12, 15/15, 6/9; criança 12/14, 15/17, 9/9; homem A 10/14, 17/19, 9/11; homem B 11/14, 15/17, 6/6. Quem pode ser o pai?

Locus 1: a criança é 12/14; o 12 veio da mãe (8/12), logo o pai deu 14. Homem A tem 14; homem B tem 14. Ambos passam. Locus 2: a criança é 15/17; a mãe só tem 15, logo o pai deu 17. Homem A tem 17; homem B tem 17. Ambos passam. Locus 3: a criança é 9/9; a mãe deu um 9 (6/9), e o outro 9 veio do pai. Homem A tem 9 (9/11); homem B é 6/6 e não tem 9. Homem B está excluído no locus 3. Com um só locus incompatível, um laboratório ainda consideraria mutação e testaria mais loci; na prova, com os dados dados, a resposta é que B não pode ser o pai e A é compatível nos três loci. Conferência: refaça para cada locus a pergunta “qual alelo da criança não está na mãe?” e olhe só esse alelo no homem.

Forense e identificação de ossadas. O mesmo raciocínio identifica vítimas de desastres e de crimes quando não há o perfil da própria pessoa: compara-se o DNA dos restos com o de parentes vivos, e os marcadores que a vítima deveria ter são deduzidos dos pais, filhos ou irmãos. No PAS 3 de 2021, o texto-base tratava do Grupo de Trabalho Perus, criado em 2014 para identificar desaparecidos políticos da ditadura enterrados num cemitério clandestino de São Paulo; o item 105 afirmava que o método de identificação das ossadas é o mesmo dos testes de paternidade, e está certo. O item 109, tipo C, trazia um gel simplificado com os marcadores da filha, da mãe dela e de quatro ossadas, e pedia qual ossada era do pai: a única que tinha todos os marcadores da filha ausentes na mãe. Quando o DNA nuclear está degradado, como em ossos antigos, usa-se o DNA mitocondrial, presente em centenas de cópias por célula e herdado só da mãe, para ligar a ossada a parentes pela linha materna; o cromossomo Y faz o mesmo pela linha paterna.

Sequenciar é ler o genoma, e o Projeto Genoma Humano leu o nosso

Sequenciar é determinar a ordem das bases de um trecho de DNA. O método clássico é o de Frederick Sanger (1977, Nobel de 1980): a polimerase copia o molde num tubo que contém, além dos nucleotídeos normais, nucleotídeos modificados que interrompem a cadeia; as cópias interrompidas em cada posição, separadas por tamanho numa eletroforese muito fina, revelam a base de cada posição. Foi com máquinas de Sanger que o Projeto Genoma Humano, iniciado em 1990 por um consórcio público internacional, publicou o rascunho da sequência em 2001 e a versão de referência em 2003, ao custo de cerca de 3 bilhões de dólares. As regiões de repetições longas, que a técnica não resolvia, só foram preenchidas em 2022 por um consórcio que usou tecnologias de leitura longa e anunciou a primeira sequência humana de ponta a ponta. Hoje, o sequenciamento de nova geração lê milhões de fragmentos ao mesmo tempo e um genoma humano custa da ordem de centenas de dólares e leva dias.

O que a leitura mostrou cabe em três números: cerca de 3,1 bilhões de pares de bases, cerca de 20 mil genes codificadores de proteína e só 1 a 2 % do total ocupado por sequências que viram proteína. O restante são íntrons, sequências reguladoras, genes de RNAs que não são traduzidos e trechos repetidos, inclusive os STR usados nos testes de identificação. O PAS 3 de 2021 (item 106) afirmou que os genes ocupam só uma fração pequena do genoma humano, e está certo. Os detalhes do genoma estão em DNA, RNA e síntese proteica.

Sequenciar genomas de outros organismos é a base de boa parte da biotecnologia atual. O primeiro genoma de um organismo patogênico de planta foi sequenciado no Brasil: o da bactéria Xylella fastidiosa, causadora da clorose variegada dos citros, por um consórcio de laboratórios paulistas, publicado em 2000. Genomas de bactérias mostram que genes uma espécie tem e, portanto, o que ela consegue fazer: o PAS 3 de 2009 (item 56) descrevia a bactéria Alcanivorax borkumensis, que se alimenta de petróleo, e concluía que o genoma dela contém trechos que codificam enzimas de quebra do petróleo, raciocínio certo, da função para a existência dos genes. O caminho inverso continua proibido: saber a função, ou mesmo a sequência de aminoácidos de uma proteína, não permite deduzir a sequência exata do gene, porque o código é degenerado. Na pandemia, o sequenciamento do genoma do SARS-CoV-2, publicado em janeiro de 2020, permitiu desenhar os iniciadores do RT-PCR e o RNA das vacinas em semanas; depois, o sequenciamento contínuo de amostras acompanhou o surgimento das variantes. Em medicina, a leitura de genes específicos orienta o tratamento de cânceres (medicina de precisão) e a escolha de doses de remédios (farmacogenética), e os testes de ancestralidade comparam marcadores do cliente com os de populações de referência.

Transgênicos: o que muda e o que não muda

Um transgênico é produzido inserindo no genoma do organismo um cassete de expressão: o gene de interesse, de outra espécie, acompanhado de um promotor que o faz ser transcrito nas células certas e de um sinal de término, geralmente junto com um gene marcador para selecionar as células que receberam o pacote. Em plantas, o cassete entra pela Agrobacterium ou pela biobalística em células em cultura, e a planta inteira é regenerada a partir delas; como o gene está em todas as células, inclusive nos gametas, ele passa às gerações seguintes como qualquer outro gene. Em animais, o DNA é injetado no zigoto ou introduzido em células-tronco embrionárias.

Os casos abaixo são os que a prova e o noticiário usam. Guarde, para cada um, três coisas: qual gene, de onde veio e para quê.

Repare na última linha. Quando os genes manipulados são da própria espécie, a planta é chamada cisgênica ou intragênica, e não transgênica no sentido estrito; mas, como houve engenharia genética, ela é OGM perante a lei. E repare no arroz dourado e no OX513A: a engenharia genética pode inserir mais de um gene, de mais de uma fonte, e até genes sintéticos montados em laboratório. A pergunta que define continua a mesma: houve inserção de DNA por técnica de laboratório?

Uma terceira categoria é recente: organismos editados, em que a CRISPR (adiante) altera, desliga ou corrige um gene do próprio organismo sem deixar DNA de outra espécie. No Brasil, a CTNBio decide caso a caso, desde 2018, se um produto editado é ou não tratado como OGM, e vários já foram liberados sem o enquadramento de transgênico. Isso explica por que a prova distingue “transgenia clássica” de “edição de genoma”: a edição não exige, necessariamente, gene de outra espécie.

Soja RR e a lógica da tolerância. Vale entender o caso mais cobrado por dentro. O glifosato mata plantas porque inibe uma enzima da via que produz aminoácidos aromáticos, a EPSPS; sem esses aminoácidos, a planta não faz proteínas e morre. A bactéria Agrobacterium linhagem CP4 tem uma versão da EPSPS que o glifosato não consegue inibir. Transferido para a soja, o gene cp4 epsps faz a planta produzir a enzima bacteriana, que continua funcionando na presença do herbicida: a lavoura pode ser pulverizada inteira, e só a soja sobrevive. O texto-base do PAS 3 de 2016 dizia que a soja comum, sob o herbicida, tem a produção de proteínas inibida, e que a modificada “é capaz de produzir proteínas mesmo sob altas doses”; é a descrição da enzima resistente. O terceiro item do bloco (79, errado) misturou os dois assuntos: afirmou que a aplicação continuada do herbicida geraria genes de resistência e deixaria as plantas portadoras, e a prole delas, imunes a herbicidas de qualquer tipo. Dois erros numa frase: o herbicida não produz genes, apenas seleciona variantes que já existiam na população; e a tolerância é a um composto, o glifosato, não a herbicidas em geral. O que a seleção natural de fato fez foi outra coisa: ervas daninhas expostas por anos ao mesmo produto foram selecionadas, e hoje há populações de buva e capim-amargoso resistentes ao glifosato, consequência da própria tecnologia.

Quem decide: CTNBio, Lei de Biossegurança e o rótulo

No Brasil, a palavra final sobre OGMs é da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), criada pela primeira Lei de Biossegurança (Lei 8.974, de 1995) e reorganizada pela atual, a Lei 11.105, de 24 de março de 2005. A CTNBio é um colegiado de especialistas de várias áreas, ligado ao Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação, que avalia, para cada OGM, a segurança para a saúde humana e animal e para o meio ambiente, e autoriza ou não a pesquisa, o cultivo e o consumo. Acima dela, o Conselho Nacional de Biossegurança, formado por ministros, pode decidir questões de conveniência socioeconômica. Dentro de cada universidade ou empresa que trabalha com OGMs há uma Comissão Interna de Biossegurança, e os laboratórios são classificados em níveis de biossegurança de 1 a 4 conforme o risco do que manipulam.

A mesma lei de 2005 responde a outras perguntas desta página. Ela proíbe a clonagem humana, a engenharia genética em células germinativas e em embriões humanos e a liberação de OGMs sem parecer da CTNBio; e permite, no artigo 5.º, o uso em pesquisa e terapia de células-tronco de embriões humanos produzidos por fertilização in vitro, inviáveis ou congelados há três anos ou mais, com o consentimento dos genitores. Esse artigo foi contestado no Supremo Tribunal Federal e considerado constitucional em 2008.

O consumidor também foi contemplado. Pelo Decreto 4.680, de 2003, todo alimento com mais de 1 % de ingrediente transgênico precisa informar isso no rótulo, com o símbolo definido por portaria do Ministério da Justiça no mesmo ano: um triângulo amarelo com a letra T. A rotulagem não é um alerta de risco, e sim um direito de informação; o óleo de soja da prateleira, feito de soja transgênica, traz o T.

O debate, em argumentos e não em opiniões. A prova não pede que você seja a favor ou contra; pede que reconheça argumentos verificáveis e os separe de generalizações. A favor: maior produtividade por hectare; menos pulverização de inseticidas nas lavouras Bt; menos revolvimento do solo onde o controle de ervas é químico; enriquecimento nutricional, como no arroz dourado; vacinas, insulina e outros remédios que não existiriam. Contra, ou em cautela: fluxo gênico, a passagem do transgene por pólen a parentes selvagens ou a lavouras convencionais; resistência de pragas às proteínas Cry e de ervas daninhas ao glifosato, por seleção natural, que exige áreas de refúgio e rotação de produtos; alergenicidade, testada caso a caso (nos anos 1990, uma soja que recebeu um gene de castanha-do-pará foi abandonada antes do mercado porque a proteína transferida era alérgeno); concentração do mercado de sementes patenteadas em poucas empresas; e o aumento do uso de glifosato associado às lavouras tolerantes. Sobre a segurança para quem come, as academias de ciências e a Organização Mundial da Saúde avaliam que os transgênicos aprovados não oferecem risco maior que os alimentos convencionais equivalentes; cada produto, porém, é avaliado separadamente, e por isso a aprovação é por evento, não por tecnologia.

Clonar: copiar um genoma inteiro

A palavra clone tem dois usos. Na clonagem molecular, clone é uma população de cópias de um gene. Na clonagem de organismos, clone é um indivíduo geneticamente idêntico a outro. A natureza faz clones o tempo todo: toda reprodução assexuada produz clones, e gêmeos monozigóticos são clones um do outro; a estaquia de uma planta, a brotação de uma batata e a divisão de uma bactéria também. O que a biotecnologia acrescentou foi clonar um mamífero adulto, o que exige fazer o núcleo de uma célula especializada voltar a comandar um desenvolvimento embrionário completo.

A técnica é a transferência nuclear de célula somática. Retira-se o núcleo de um óvulo (óvulo enucleado); funde-se a ele uma célula do corpo do animal a clonar, ou injeta-se o núcleo dessa célula; um pulso elétrico estimula o início das divisões; o embrião se desenvolve em cultura até o estágio de blastocisto e é implantado no útero de uma fêmea receptora. O filhote tem o DNA nuclear do doador da célula somática. Em 1962, John Gurdon mostrou em rãs que o núcleo de uma célula intestinal podia gerar um girino inteiro, prova de que a diferenciação não apaga genes, apenas os silencia; e em 1996, no Instituto Roslin, na Escócia, Ian Wilmut e Keith Campbell aplicaram o método a um mamífero. A ovelha Dolly nasceu em 5 de julho de 1996 de um núcleo de célula de glândula mamária de uma ovelha de seis anos, transferido para o óvulo de uma ovelha de outra raça e gestado por uma terceira. Foram 277 óvulos reconstruídos para um único cordeiro, e o anúncio, em fevereiro de 1997, abriu o debate sobre clonagem humana. Dolly teve seis filhotes por reprodução normal e morreu em 2003, aos seis anos, de uma doença pulmonar causada por vírus, comum em ovelhas criadas em estábulos; a discussão sobre se ela “nasceu velha”, pelos telômeros mais curtos do núcleo adulto, continua sem resposta definitiva. Depois dela vieram bezerros, inclusive a bezerra Vitória, primeiro clone bovino do Brasil (Embrapa, 2001), cavalos, cães, gatos e, em 2018, os primeiros macacos clonados por essa técnica, na China.

Clone não é cópia. Dolly e a ovelha doadora tinham o mesmo DNA nuclear, mas não eram idênticas. As mitocôndrias, com o seu DNA próprio, vieram do óvulo da outra ovelha; a expressão dos genes depende de marcas epigenéticas que a reprogramação do núcleo não restaura por completo; e o ambiente, da gestação em diante, molda o fenótipo. O primeiro gato clonado, em 2001, nasceu com pelagem de padrão diferente do da doadora, porque a distribuição das manchas depende de eventos aleatórios no embrião. Um item que afirme que um clone é “exatamente igual” ao doador em tudo está errado; um que afirme que compartilha o genoma nuclear está certo.

Clonagem reprodutiva e terapêutica. Quando o embrião reconstruído é implantado e nasce um indivíduo, a clonagem é reprodutiva. Quando o embrião é cultivado só até o blastocisto, para dele retirar células-tronco geneticamente idênticas ao doador do núcleo, é clonagem terapêutica: o objetivo são tecidos compatíveis, que o sistema imune do paciente não rejeitaria, para tratar lesões e doenças degenerativas. A clonagem terapêutica humana foi conseguida em 2013, mas perdeu espaço para uma técnica que chega ao mesmo tipo de célula sem óvulo nem embrião, as células-tronco pluripotentes induzidas, da próxima seção. No Brasil, a Lei 11.105/2005 proíbe a clonagem humana, sem distinguir finalidade.

Células-tronco: a potência decide o uso

Uma célula-tronco tem duas propriedades: divide-se mantendo-se indiferenciada (autorrenovação) e pode originar células especializadas (diferenciação). O que varia é até onde vai essa capacidade, a potência.

• Totipotente: origina qualquer célula do embrião e também os anexos embrionários, como a placenta. É o zigoto e as células das primeiras divisões.
• Pluripotente: origina qualquer célula do corpo, mas não os anexos. São as células da massa celular interna do blastocisto, as células-tronco embrionárias, cultivadas a partir de embriões humanos pela primeira vez em 1998.
• Multipotente: origina os tipos celulares de um tecido ou de uma família de tecidos. São as células-tronco adultas, como as hematopoéticas da medula óssea, que produzem todas as células do sangue, e as mesenquimais, que formam osso, cartilagem e gordura. O sangue do cordão umbilical é rico em células hematopoéticas e por isso é guardado em bancos públicos.

A aplicação mais antiga e consolidada é o transplante de medula óssea, feito desde os anos 1960: células-tronco hematopoéticas de um doador compatível substituem a medula de um paciente com leucemia ou outra doença do sangue. O Brasil mantém um dos maiores registros de doadores voluntários do mundo, o REDOME, e bancos públicos de sangue de cordão. Transplantar medula não é terapia gênica: nenhum gene é inserido, trocam-se células.

As células-tronco embrionárias prometem muito mais, porque formam qualquer tecido, mas levantam duas dificuldades: a destruição de um embrião para obtê-las e a rejeição imune, já que o embrião não é do paciente. Em 2006, Shinya Yamanaka mostrou que bastava introduzir quatro genes de fatores de transcrição numa célula da pele de camundongo para reprogramá-la a um estado pluripotente; em 2007, repetiu com células humanas. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são do próprio paciente, não exigem embrião e renderam a Yamanaka o Nobel de 2012, dividido com Gurdon, cujas rãs de 1962 haviam mostrado que o núcleo diferenciado guarda o genoma inteiro. As iPS são hoje usadas para produzir em cultura neurônios, células cardíacas e retinianas de pacientes, para estudar doenças e testar remédios, e os primeiros tratamentos com tecidos derivados delas estão em ensaio clínico.

O PAS 3 de 2009 (item 84) explorou uma confusão de vocabulário: afirmou que, no organismo humano, o RNA de interferência elimina RNAs mensageiros anômalos (isso o texto dizia) e que “as células-tronco suprem o organismo de células geneticamente alteradas”. Errado: células-tronco repõem células normais de um tecido; não são fonte de células alteradas, e nada no texto as ligava ao iRNA.

Terapia gênica: inserir um gene que funciona

Terapia gênica é o tratamento de uma doença pela entrega de uma cópia funcional de um gene às células do paciente, para compensar um gene defeituoso ou acrescentar uma função. A definição tem dois termos obrigatórios, inserir e gene funcional, e a prova testa a definição pela negativa, descrevendo coisas parecidas que não a cumprem.

O gene entra por um vetor, quase sempre um vírus desarmado: adenovírus, vírus adenoassociados (AAV) e lentivírus derivados do HIV, dos quais se retiram os genes de replicação. Há duas vias. Na terapia ex vivo, células do paciente (por exemplo, as hematopoéticas da medula) são retiradas, modificadas em cultura e devolvidas. Na terapia in vivo, o vetor é injetado no corpo e procura o tecido-alvo. O primeiro ensaio clínico foi em 1990, numa menina com imunodeficiência por falta da enzima ADA; em 1999, a morte de um voluntário por reação ao vetor adenoviral freou a área por uma década. Os sucessos vieram depois: um tratamento para uma cegueira hereditária da retina (2017), um para a atrofia muscular espinhal, que entrega o gene SMN1 por AAV numa única infusão e foi aprovado no Brasil em 2020, e as terapias com células CAR-T, em que linfócitos T do paciente recebem o gene de um receptor que reconhece o câncer. O custo, de milhões de reais por dose, é o debate central hoje.

O que não é terapia gênica, com os itens reais que fixaram a fronteira:

• Silenciar um gene com RNA de interferência. O PAS 3 de 2009 (item 86) definiu terapia gênica no enunciado e perguntou se um experimento que injetava em camundongos um RNA de dupla fita para destruir o RNA mensageiro de um gene do Schistosoma mansoni era terapia gênica. Não: o RNA bloqueia a tradução de um gene do verme, e nenhum gene funcional é inserido em célula alguma. No mesmo bloco, o item 83 chamou o iRNA de “vacina”, também errado: ele não estimula o sistema imune nem previne infecção; destrói um RNA.
• Selecionar um embrião. O mesmo caderno de 2009 contava o nascimento de uma menina britânica concebida por FIV depois de os médicos escolherem, entre os embriões disponíveis, um livre da mutação no gene BRCA1, ligada ao câncer de mama e de ovário. Escolher, entre os embriões, um que não tem a mutação é diagnóstico genético pré-implantacional, e nenhum gene foi inserido: a menina não é portadora (item 93, que a chamou de heterozigota, errado) e tem o risco de câncer de qualquer mulher sem a mutação, não um risco menor que o da população em geral (item 92, errado).
• Transplantar células. Medula, cordão ou iPS repõem células; a terapia gênica muda genes.
• Dar a proteína. A insulina recombinante e a vacina antiangiotensina de 2014 são produtos de genes fabricados fora do corpo; terapia gênica entrega o gene, para o corpo fabricar.

CRISPR-Cas9: a tesoura que acha o endereço

Até 2012, alterar um gene específico dentro de um genoma de bilhões de bases era caro, lento e pouco preciso. A CRISPR-Cas9 mudou isso, e a técnica veio, de novo, da defesa das bactérias. Muitas bactérias guardam no cromossomo uma coleção de pedaços de genomas de vírus que já as atacaram, intercalados em repetições (é o que a sigla CRISPR nomeia). Quando o mesmo vírus volta, a bactéria transcreve esses pedaços em RNAs curtos, que guiam a proteína Cas9 até o DNA do invasor; a Cas9 corta as duas fitas, e o vírus é destruído. Em 2012, Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna mostraram que bastava sintetizar um RNA-guia com a sequência desejada para a Cas9 cortar qualquer DNA naquele ponto; as duas receberam o Nobel de Química de 2020.

O mecanismo tem três passos. O RNA-guia, de cerca de 20 nucleotídeos, pareia com a sequência-alvo. A Cas9 só corta se, logo ao lado do alvo, existir uma sequência curta chamada PAM, o que limita, mas não impede, a escolha de alvos. Feito o corte de dupla fita, a célula o repara por um de dois caminhos, e é o reparo que faz a edição. No reparo por junção de extremidades, a célula emenda as pontas de modo impreciso e costuma inserir ou perder algumas bases: a fase de leitura se desloca e o gene é desligado, o nocaute. No reparo por recombinação homóloga, se o pesquisador fornecer junto um molde de DNA com a sequência desejada, a célula o copia ao consertar o corte: a mutação é corrigida ou um gene novo é inserido no ponto exato. Versões mais recentes, os editores de bases e o prime editing, trocam uma letra sem cortar as duas fitas.

Onde já está. O primeiro tratamento com CRISPR aprovado, no fim de 2023, trata a anemia falciforme e a beta-talassemia: células-tronco da medula do paciente são retiradas, editadas para religar a produção da hemoglobina fetal, que não forma foice, e devolvidas. É edição somática: muda as células do paciente e morre com ele, sem passar aos filhos. Em plantas, a CRISPR produziu tomates, trigo, arroz e cana com genes desligados, e, como pode não restar DNA de fora, muitos desses produtos não são tratados como transgênicos. Em pesquisa, serve para desligar um gene de cada vez e descobrir a função dele.

Onde não deve estar. Em novembro de 2018, o pesquisador chinês He Jiankui anunciou o nascimento de duas gêmeas cujos embriões ele editara com CRISPR no gene CCR5, numa tentativa de torná-las resistentes ao HIV. Foi edição germinativa: a alteração está em todas as células das meninas, inclusive nos óvulos, e passará aos descendentes delas. O experimento não tinha justificativa médica, a edição saiu incompleta, e os riscos de cortes fora do alvo eram desconhecidos. He foi condenado na China a três anos de prisão, e a comunidade científica pediu moratória à edição germinativa humana. No Brasil, a Lei 11.105/2005 já proibia a engenharia genética em células germinativas e embriões humanos.

Biotecnologia e vacinas: a plataforma é o produto

A imunologia das vacinas, com antígeno, anticorpo, memória e os tipos de vacina do calendário, está em vacinas e soros. Aqui interessa o que três plataformas têm de engenharia genética.

Proteína recombinante. A vacina da hepatite B não contém vírus: contém a proteína da superfície dele, produzida por leveduras que receberam o gene viral, purificada e adsorvida num adjuvante. Foi a primeira vacina de engenharia genética, nos anos 1980, e o modelo da vacina contra o HPV, cujas proteínas recombinantes se montam sozinhas em partículas ocas parecidas com o vírus.

RNA mensageiro. As vacinas de RNA mensageiro usadas na pandemia, aprovadas em dezembro de 2020, contêm o RNA mensageiro da proteína S do SARS-CoV-2, sintetizado em laboratório a partir da sequência do genoma viral e embalado em nanopartículas de lipídio para entrar nas células. Os ribossomos do vacinado traduzem o RNA, a proteína S aparece na superfície das células e o sistema imune responde; o RNA é degradado em dias. As descobertas que tornaram o RNA sintético tolerável pelo organismo renderam a Katalin Karikó e Drew Weissman o Nobel de Medicina de 2023. O PAS 3 de 2020 (item 77) afirmou que o RNA da vacina “se insere no DNA do hospedeiro”, e está errado: o RNA fica no citoplasma, a célula humana não tem transcriptase reversa para copiá-lo em DNA e nada chega ao núcleo. É o dogma central em ação.

Vetor viral. A vacina de Oxford e AstraZeneca, produzida no Brasil pela Fiocruz, usa um adenovírus de chimpanzé que recebeu o gene da proteína S e perdeu os genes de replicação: ele entra na célula, entrega o gene, a célula produz a proteína S, e o vírus não se multiplica. É o mesmo tipo de vetor da terapia gênica, com um objetivo diferente: provocar imunidade, não corrigir um gene. O DNA do vetor fica no núcleo como molécula separada, sem se integrar ao cromossomo, e é eliminado.

O que une as três plataformas: o produto final que o sistema imune vê é uma proteína do patógeno, produzida ou fora do corpo (recombinante) ou dentro das células do vacinado (RNA e vetor viral), e em nenhum caso o genoma do vacinado muda.

Fábricas vivas: quem produz o quê

A escolha do organismo produtor segue a regra da tabela da seção da insulina: bactéria para proteínas simples, levedura ou célula animal para as que exigem acabamento. O que a indústria acrescenta àquela lista são produtos que não são remédios. Bactérias com genes adicionados fabricam plásticos biodegradáveis como o PHB; leveduras modificadas para digerir celulose fermentam o bagaço da cana em etanol de segunda geração; fungos filamentosos produzem antibióticos e as amilases e lipases dos detergentes; e plantas transformadas produzem proteínas em folhas e sementes, como o coquetel de anticorpos testado contra o ebola em 2014, fabricado em tabaco.

Dois usos fogem da fábrica. Na biorremediação, microrganismos que já comem poluentes, ou que receberam genes para isso, limpam solos e águas: bactérias degradadoras de hidrocarbonetos, como a Alcanivorax do item de 2009, multiplicam-se em manchas de óleo e foram estudadas no vazamento do Golfo do México em 2010. Na nanobiotecnologia, extratos de plantas ou microrganismos reduzem íons metálicos a nanopartículas, de 1 a 100 nanômetros, usadas como antimicrobianos e em biossensores. O nanômetro é um bilionésimo de metro ($10^{-9}$ m); uma hemácia tem cerca de 7 micrômetros, ou 7 000 nanômetros. O PAS 3 de 2017 (item 42) afirmou que nanopartículas de prata produzidas pela Embrapa teriam “aproximadamente o mesmo tamanho de uma célula sanguínea”, e está errado por um fator de dezenas a milhares de vezes: a escala nano é a das moléculas e dos vírus, muito abaixo da de qualquer célula.

Bioética e biossegurança: o que a lei já respondeu e o que ainda não

A engenharia genética nasceu com uma pausa. Em 1975, na conferência de Asilomar, os próprios pesquisadores do DNA recombinante suspenderam experimentos até definir regras de contenção, origem dos níveis de biossegurança usados até hoje. Desde então, as perguntas se repetem em cada técnica nova, e vale saber quais já têm resposta legal no Brasil.

Fora da lei, ficam as perguntas abertas. Patentes: pode-se patentear um gene? Nos Estados Unidos, a Suprema Corte decidiu em 2013 que genes humanos naturais não são patenteáveis, só sequências sintéticas; no Brasil, a lei de propriedade industrial não permite patentear seres vivos naturais nem partes deles. Acesso: terapias gênicas custam milhões por paciente, e o SUS já enfrentou a decisão de incorporar ou não o tratamento da atrofia muscular espinhal. Consentimento e privacidade: um genoma sequenciado informa sobre os parentes de quem o cedeu, e bancos de DNA forenses levantam a questão de quem pode ser incluído. Fronteira germinativa: três cúpulas internacionais (2015, 2018 e 2023) concluíram que a edição de embriões humanos para gestação é prematura, sem proibi-la em definitivo. E o Protocolo de Cartagena (2000, em vigor no Brasil desde 2003) regula o comércio internacional de OGMs vivos. Um item de prova sobre esses temas pede duas habilidades: separar o que a lei fixa do que é opinião, e separar o fato (a técnica faz X) da tese (a técnica deve ou não ser usada).

Como ler géis, esquemas e curvas na prova

As questões de biotecnologia chegam em quatro formatos.

Um gel. Identifique o poço (as bandas perto dele são as grandes), a raia do marcador e o que cada raia representa. Em restrição, conte bandas e some tamanhos: a soma tem de dar o tamanho da molécula. Em paternidade ou identificação, faça a subtração do genitor conhecido e exija da resposta todas as bandas restantes. Em eletroforese de proteína, a banda em posição diferente indica carga ou tamanho diferente.

Um esquema de clonagem. Localize quatro elementos: a enzima de restrição (a mesma para gene e vetor), o vetor com sua origem e seu marcador, a ligase e a etapa de seleção. A pergunta mais comum é por que só algumas bactérias crescem na placa: porque só as que receberam o plasmídeo têm o gene de resistência. A segunda é de que organismo são as células que produzem a proteína: da bactéria, com o gene humano dentro.

Uma curva de PCR. A curva de cópias contra ciclos é exponencial no início, por isso em escala logarítmica é uma reta; a tabela de $2^{n}$ resolve as contas. Numa curva de fluorescência em tempo real, a amostra com mais material ultrapassa o limiar em menos ciclos.

Um texto-base com vocabulário. Os itens trocam palavras: inserir por selecionar, gene por célula, ativar por suprimir, RNA por DNA, amplificar por sequenciar, silenciar por inserir, somática por germinativa, nano por micro. Leia o item procurando a palavra trocada antes de julgar a frase inteira. Em 2019, o item sobre a cana tolerante à seca trocou o objetivo (manter genes ativos) pelo contrário (suprimir a expressão); em 2016, trocou a técnica (inserção de gene exógeno) pela outra (seleção e cruzamentos); em 2019, trocou o que o transgênico recebe (um trecho de DNA) por células do doador.

Exemplo resolvido: julgar quatro afirmações sobre o mesmo esquema. Um esquema mostra o gene da insulina humana e um plasmídeo com gene de resistência à ampicilina cortados pela mesma enzima, unidos por ligase, introduzidos em E. coli e semeados em meio com ampicilina. Julgue: (I) as bactérias que crescem na placa são transgênicas; (II) a insulina produzida terá a sequência de aminoácidos da insulina humana porque o código genético é universal; (III) o gene humano precisou ser cortado pela mesma enzima que cortou o plasmídeo para que as extremidades fossem complementares; (IV) o paciente que usar a insulina receberá o gene humano modificado.

(I) Certo: receberam DNA de outra espécie por engenharia genética. (II) Certo: os códons têm o mesmo significado na bactéria, e a tradução segue a sequência do gene; o detalhe de que o gene deve ser um cDNA sem íntrons não muda o julgamento. (III) Certo: é a lógica das extremidades coesivas. (IV) Errado: o paciente recebe a proteína purificada; nem o gene nem a bactéria chegam a ele, e o seu genoma não muda. É o mesmo erro do item de 2014 sobre a vacina recombinante e a taxa de mutações.

Erros que derrubam itens

1. “Biotecnologia é sinônimo de transgênico.” Pão, iogurte, penicilina, etanol e todo melhoramento genético são biotecnologia sem gene inserido.
2. “Um organismo domesticado ou melhorado é OGM.” Seleção artificial muda frequências de alelos; não insere DNA (PAS 3 2016, item 78; 2025, item 68).
3. “O transgênico é feito de células do doador.” Recebe um trecho de DNA; as células são todas suas (PAS 3 2019, item 43).
4. “O herbicida produz genes de resistência e deixa a planta imune a qualquer herbicida.” O herbicida seleciona variantes que já existiam, não as cria; e a tolerância é a um composto específico (PAS 3 2016, item 79).
5. “Uma proteína recombinante altera o DNA de quem a recebe.” O paciente recebe o produto do gene, não o gene (PAS 3 2014, item 82).
6. “PCR sequencia o DNA.” PCR copia um trecho; sequenciar é ler a ordem das bases.
7. “A PCR usa helicase para abrir o DNA.” A separação é térmica, a 95 °C; a enzima é a Taq polimerase, que resiste ao calor.
8. “Na eletroforese, os fragmentos grandes correm mais.” Correm menos; os pequenos vão mais longe, em direção ao polo positivo.
9. “Compartilhar algumas bandas prova parentesco.” Exige todos os marcadores que não vieram do outro genitor (PAS 3 2021, item 109).
10. “Teste de paternidade e identificação de ossadas usam métodos diferentes.” É o mesmo método de marcadores herdados metade de cada genitor (PAS 3 2021, item 105).
11. “Genoma e gene são a mesma coisa.” Só 1 a 2 % do genoma humano codifica proteínas (PAS 3 2021, item 106).
12. “Silenciar um gene por iRNA é terapia gênica.” Terapia gênica insere gene funcional; silenciar não insere nada (PAS 3 2009, item 86). E iRNA não é vacina (item 83).
13. “Selecionar um embrião sem a mutação é terapia gênica.” Nenhum gene foi inserido; a criança não é portadora e tem o risco da população geral (PAS 3 2009, itens 92 e 93).
14. “Transplante de medula é terapia gênica.” Troca células; não insere gene.
15. “O clone é idêntico ao doador em tudo.” Mesmo DNA nuclear; mitocôndrias do óvulo, epigenética e ambiente diferentes.
16. “Dolly foi feita com DNA recombinante.” Foi transferência nuclear; nenhum gene de fora.
17. “Célula-tronco adulta forma qualquer tecido.” É multipotente; pluripotentes são as embrionárias e as iPS.
18. “CRISPR é transgenia.” Pode inserir gene, mas o uso comum é desligar ou corrigir um gene do próprio organismo; a CTNBio avalia caso a caso.
19. “Edição em embrião afeta só a criança.” É germinativa: passa aos descendentes, e é proibida no Brasil.
20. “O RNA da vacina entra no DNA.” Fica no citoplasma, é traduzido e degradado (PAS 3 2020, item 77).
21. “Nanopartícula tem o tamanho de uma célula.” 1 nm é um bilionésimo de metro; uma hemácia tem 7 000 nm (PAS 3 2017, item 42).
22. “A CTNBio aprova a tecnologia.” Aprova evento por evento, com avaliação de risco própria para cada OGM.

O essencial em meia página

• Biotecnologia = uso de organismos ou moléculas deles em processos. Clássica: fermentação, melhoramento, domesticação (sem DNA de fora). Moderna: DNA recombinante (1973). Transgênico = recebeu gene de outra espécie; OGM = qualquer modificação por engenharia genética; domesticado ≠ OGM.
• Ferramentas: enzima de restrição (sítio palindrômico, extremidades coesivas ou cegas), DNA ligase, vetor (plasmídeo com origem, marcador e sítio de clonagem; vírus; Agrobacterium; biobalística), transformação e seleção por antibiótico. Linear: fragmentos = cortes + 1; circular: fragmentos = cortes.
• Gene humano em bactéria funciona porque o código é universal; usa-se cDNA (sem íntrons); proteínas com açúcares exigem levedura ou célula animal. Insulina recombinante: 1978 em E. coli, aprovada em 1982.
• PCR: 95 °C desnatura, 50 a 65 °C anela os iniciadores, 72 °C a Taq estende; $2^{n}$ cópias; 30 ciclos ≈ 10⁹. RT-PCR copia RNA em cDNA antes (covid, HIV); qPCR mede pelo Ct. PCR copia; não lê.
• Eletroforese: DNA negativo migra ao polo +; pequeno corre mais; marcador de tamanho. STR: dois alelos por locus, um de cada genitor; paternidade por subtração; exclusão em dois ou mais loci; ossadas pelo mesmo método (2021/105 e 109); DNA mitocondrial pela linha materna.
• Sequenciamento: Sanger 1977; Projeto Genoma Humano 1990 a 2003, sequência completa 2022; 3,1 bilhões de pb, cerca de 20 mil genes, 1 a 2 % codificante. Função → existem genes (2009/56); proteína → sequência do gene, não.
• Transgênicos: soja RR (cp4 epsps, Agrobacterium), Bt (cry, B. thuringiensis), arroz dourado (betacaroteno), Aedes OX513A (CTNBio 2014), feijão Embrapa 5.1 (2011), cana Bt (2017). Cisgênico = gene da própria espécie; editado = sem gene de fora, caso a caso. Lei 11.105/2005: CTNBio avalia evento por evento; rótulo T acima de 1 % (Decreto 4.680/2003).
• Clonagem: transferência nuclear de célula somática; Dolly (1996, 277 óvulos); clone = mesmo DNA nuclear, mitocôndrias do óvulo. Reprodutiva (nasce indivíduo) × terapêutica (células-tronco compatíveis). Clonagem humana proibida.
• Células-tronco: totipotente (zigoto), pluripotente (embrionária, iPS), multipotente (adulta, cordão). iPS: Yamanaka 2006, Nobel 2012. Medula óssea = transplante de células, não terapia gênica. Lei: embriões de FIV inviáveis ou congelados ≥ 3 anos.
• Terapia gênica = inserir gene funcional (vetor viral, ex vivo ou in vivo). Não é: iRNA (2009/86), seleção de embriões (2009/92 e 93), transplante, proteína recombinante (2014/82).
• CRISPR-Cas9: RNA-guia + Cas9 + PAM → corte → junção de extremidades (nocaute) ou recombinação com molde (correção). Nobel 2020. Somática fica; germinativa passa e é proibida. Bebês CRISPR (2018) = o caso a não repetir.
• Vacinas: recombinante (hepatite B em levedura), RNA (traduzido no citoplasma, não entra no DNA, 2020/77), vetor viral (adenovírus sem replicação). Em todas, o genoma do vacinado não muda.
• Nano = $10^{-9}$ m; hemácia = 7 µm = 7 000 nm (2017/42). Biorremediação: bactérias com genes de enzimas que degradam o poluente.